O jogo começa imediatamente após os eventos de Assassin's Creed. Desmond e a aspirante a assassina Lucy Stillman escapam do labóratorio de Abstergo, seguindo para um esconderijo dos assassinos. Desmond descobre que os assassinos, com poucos recursos e dinhero, estão tendo dificuldades para vencer os templários. Stillman, um dos assassinos, revela que ele e uma nova equipe têm trabalhado em um novo dispositivo, o Animus 2.0. Desmond então vê as memórias de um novo assassino através da nova máquina.
O jogador assume o papel de um jovem nobre que se tornou assassino, chamado Ezio Auditore da Firenze. O pai de Ezio e seus irmãos, acusados de trair a cidade de Florença, são executados em praça pública. Ezio também seria executado, porém consequiu escapar da morte. Ezio então parte junto com sua mãe e sua irmã, para a vila dos Auditore, onde descobre que seus irmãos e seu pai eram secretamente assassinos.
Ezio passa a ajudar seu tio Mario na guerra entre os templários e os assassinos, com o intuito de se vingar dos causadores da morte de sua família. Como Altair no primeiro jogo, Ezio é um ascendente de Desmond Miles, o barman dos dias modernos que foi capturado em Abstergo, com o próprio Ezio sendo descendente de Altair.
